高純度二苯乙烯苷制備工藝及其抗衰老機(jī)制研究
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衰老，本世紀(jì)生物學(xué)研究重點課題，通常定義為正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能逐步退行性變異，趨向死亡，不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，分為生理性衰老（正常衰老）、病理性衰老（異常衰老）兩種類型。尋找可延緩衰老進(jìn)程的活性成分不僅是全世界人們的期望，更是醫(yī)藥研究者們的責(zé)任和義務(wù)。二苯乙烯苷，源自素有抗衰老靈藥之稱的蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb，其化學(xué)名為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；目前國內(nèi)外尚未見高純度二苯乙烯苷（含量＞95.0%）規(guī)模生產(chǎn)工藝的報道。既往研究表明，二苯乙烯苷對多種衰老相關(guān)疾病如動脈粥樣硬化、癌癥等病癥具有明顯治療作用，可清除體內(nèi)過量自由基，可能通過作用Sirtuin蛋白家族延緩衰老進(jìn)程。藉此提示我們，二苯乙烯苷具有明確的抗衰老作用，但其抗衰老的作用靶點及其機(jī)制尚未闡明。Klotho基因及分泌型Klotho蛋白，表達(dá)于遠(yuǎn)端腎小管及腦脈絡(luò)叢，通過對胰島素/IGF-1信號通路及p53基因的調(diào)控影響衰老進(jìn)程，是衰老機(jī)制研究的熱門靶點。本課題綜合運用藥物化學(xué)、植物化學(xué)、藥理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等實驗技術(shù)及方法，在優(yōu)化二苯乙烯苷提取分離純化工藝的基礎(chǔ)上，研究二苯乙烯苷抗衰老新靶點及其機(jī)制，為進(jìn)一步研制抗衰老藥物提供新思路。1二苯乙烯苷的提純工藝研究1.1二苯乙烯苷提?。喝『问诪躏嬈?，用1-10%甘草-乙醇溶液噴灑或稍浸，潤透，照《中國藥典》（2010年版一部，附錄ⅡD）蒸法，蒸至內(nèi)外均一色，曬干，粉碎成粗粉（10-40目），上樣于超臨界CO2萃取儀的萃取釜中萃取，濃縮，萃取壓力30-40Mpa，萃取溫度60℃,萃取1-3小時，必要時可采用70-90%乙醇作為夾帶劑，用量為200-400ml/小時，得萃取液，濃縮。濃縮液上樣于硅膠柱層析（200-300目）純化，用20-80%乙醇梯度洗脫，流速為1.0ml/分鐘，收集洗脫液，蒸除乙醇，得二苯乙烯苷粗品。1.2二苯乙烯苷純化及含量測定方法：純化方法一，以乙酸乙酯萃取后反復(fù)重結(jié)晶為主要手段，獲得高純度二苯乙烯苷；方法二，通過大孔吸附樹脂吸附，獲得高純度二苯乙烯苷。含量測定采用HPLC法，以乙腈和水為流動相，以稀乙醇定容待測樣品，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=32899840x+123968，r=0.9994，精密度RSD＝0.29%，重復(fù)性RSD＝0.26%，穩(wěn)定性RSD＝1.03%等。1.3二苯乙烯苷中試研究：二苯乙烯苷的提取率為2.65%（2.21-3.34%/8批次）；按照方法一純化，二苯乙烯苷純度97.3%（95.6-98.7%/4批次），二苯乙烯苷平均產(chǎn)率80.4%，RSD=2.03%；方法二純化，二苯乙烯苷純度97.5%（96.2-98.3%/4批次），平均產(chǎn)率為85.0%，RSD=3.81%。2二苯乙烯苷抗衰老作用靶點及其機(jī)制研究2.1對果蠅生命周期的影響：以倍比稀釋法獲得二苯乙烯苷水溶液(2mg·ml-1、20mg·ml-1、200mg·ml-1)，加入果蠅培養(yǎng)基，以何首烏提取物加入果蠅培養(yǎng)基做參照，觀察各組50%果蠅存活時間、5%幸存果蠅存活時間、果蠅平均生命周期，表明二苯乙烯苷可提高果蠅攀爬能力，延長果蠅生命周期（雄14.3%、雌29.2%，p＜0.01，vs.空白組），證實二苯乙烯苷具抗衰老作用。2.2對病理性衰老小鼠的作用：用D-半乳糖皮下注射的方法建立小鼠病理性衰老模型，48天后采用水迷宮法檢測小鼠記憶功能，確定造模成功后，以二苯乙烯苷(含量≥70.0%，42mg·kg-1、84mg·kg-1、168mg·kg-1)生理鹽水溶液或等量生理鹽水給小鼠灌胃，每日一次，于給藥第29天及給藥第57天上午，麻醉采血后處死小鼠，制備血清，大腦、心臟、腎臟、睪丸、附睪組織勻漿和組織蠟塊備用。以水迷宮實驗配合ELISA試劑盒、熒光實時定量PCR、免疫組化、HE染色法及病理切片進(jìn)行測定，結(jié)果：①二苯乙烯苷可改善小鼠因病理性衰老引起的記憶衰退并調(diào)節(jié)體重至健康范圍；②減少小鼠血清中自由基、一氧化氮、IGF-1含量（p＜0.01，vs.空白組）；③提高血清中超氧化物歧化酶、鈣離子、Klotho蛋白水平（p＜0.01，vs.空白組）；④促進(jìn)大腦及腎臟中Klotho基因表達(dá)（p＜0.01，vs.空白組）；⑤增加Klotho蛋白在大腦、心臟、腎臟、睪丸、附睪中表達(dá)（p＜0.01，vs.空白組），且8周藥效優(yōu)于4周，168mg·kg-1優(yōu)于其它兩劑量組。說明二苯乙烯苷能調(diào)控病理性衰老小鼠體內(nèi)Klotho基因及蛋白表達(dá)，其抗衰老機(jī)制與Klotho基因及蛋白相關(guān)。2.3對生理性衰老小鼠的作用：選用18月齡、雄性、自然衰老小鼠，灌胃給予二苯乙烯苷(含量≥95.0%，124mg·kg-1)生理鹽水溶液，對照組給予何首烏提取物(二苯乙烯苷含量≥70.0%，168mg·kg-1)生理鹽水溶液，空白組給予等量生理鹽水，每日一次，給藥8周后，第57天上午，麻醉采血后處死小鼠，制備血清，大腦、心臟、腎臟、皮膚組織勻漿和組織蠟塊備用。采用ELISA試劑盒配合熒光實時定量PCR、免疫組化、HE染色法、western blot及病理切片，發(fā)現(xiàn)：①二苯乙烯苷可減輕老年小鼠體重，減少老年小鼠皮下脂肪細(xì)胞數(shù)量、厚度及面積（p＜0.01，vs.空白組），促進(jìn)Klotho蛋白在腎臟、大腦表達(dá)（p＜0.01，vs.空白組），降低大腦及腎臟中胰島素、胰島素受體、IGF-1水平（p＜0.01，vs.空白組），降低腎臟及心臟中IGF-1受體水平（p＜0.01，vs.空白組）；②何首烏提取物可降低腎臟中胰島素、IGF-1水平（p＜0.01，vs.空白組），降低腎臟及心臟中胰島素受體水平（p＜0.01，vs.空白組），升高大腦及心臟中胰島素水平（p＜0.01，vs.空白組），升高心臟中IGF-1水平（p＜0.01，vs.空白組），升高腎臟及大腦中IGF-1受體水平（p＜0.01，vs.空白組）。綜上，以何首烏為原料，優(yōu)化并制定了二苯乙烯苷提取和純化制備工藝，以“一種二苯乙烯苷注射劑及其制備工藝”申報中國發(fā)明專利（申請?zhí)?01110196199.6），該工藝技術(shù)為規(guī)?；纤幧a(chǎn)提供了方法保障。研究證實，二苯乙烯苷對果蠅、病理型衰老小鼠及自然衰老小鼠具有顯著抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)該抗衰老的作用靶點主要是小鼠體內(nèi)Klotho蛋白，其可能的作用機(jī)制與調(diào)控Klotho蛋白含量及胰島素/IGF-1通路信號因子水平相關(guān)。本研究結(jié)果為揭示二苯乙烯苷抗衰老確切機(jī)制和進(jìn)一步研制抗衰老新藥奠定了重要基礎(chǔ)。
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